作者：李华 李伯勤 应馨萍
       来源：上海中医药大学学报
       摘要 目的：探讨虫草多糖(cp)对皮肤成纤维细胞光老化保护作用中对胶原的影响。方法：用8-甲氧补骨脂素联合uva(8-mop/uva)诱导皮肤成纤维细胞光老化，用电镜观察、羟脯氨酸含量、丙二醛含量测定及免疫细胞化学等方法观察虫草多糖对成纤维细胞光老化过程中胶原的影响。结果：光老化组细胞较对照组蛋白合成功能不活跃，羟脯氨酸含量下降，丙二醛含量升高，ⅰ型胶原表达降低，ⅲ型胶原表达增高，虫草保护组细胞有所改善。结论：虫草多糖对8-mop/uva诱导光老化的皮肤成纤维细胞胶原变化具有逆转作用。
       皮肤是机体最大的器官，皮肤老化是机体衰老的重要组成部分，皮肤老化包括两个过程，内在老化(intrinsic或chrondogic aging)和光老化(actinic aging或photoaging)。前者主要受遗传和代谢等因素的影响，可通过改善全身营养代谢平衡等措施加以防护；后者则主要由长期紫外线照射所致，只能通过避免阳光照射和使用防晒药物来预防，而在实际生活中后者是很难避免的。另外，在医学上，皮肤光老化一方面是皮肤科里最常见的一种治疗副作用之一，例如银屑病、白癜风、慢性湿疹、异位性皮炎、严重脂溢性皮炎等疾病，主要的治疗方法是光敏药物合并光照治疗，产生的最主要的副作用就是光老化；另外又是光老化性皮肤病的主要症状，光老化性皮肤病是日晒后发生的多形性光变态反应性皮肤病，是高原地区较为常见的一种光敏性皮肤病。最后，光老化还与许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、基底细胞癌、鳞状细胞癌等的发生也有着病因学的关系，而且有损于美容，因此预防和延缓皮肤光老化已成为生命科学特别是皮肤病学科的研究热点之一。目前对光老化的防护主要是化学制剂涂抹，但长期应用化学制剂均有各种毒副作用。中草药是天然药物，副作用少，容易被人们接受，有人用冬虫夏草来抗皮肤衰老，但其是否有效及其作用机制还未见报道。本实验室在小鼠在体和离体实验中均发现虫草多糖(cp)对uva/8-mop诱导的皮肤光老化具有保护作用 ，并进一步研究虫草多糖对皮肤成纤维细胞中胶原表达变化的影响。
       1 材料与方法
       1.1 药物和制剂 虫草多糖由中草药冬虫夏草提取，纯度大于95％ ，由上海中医药大学肝病所提供。prm1640培养基、edta-胰酶购自gibco公司，胎牛血清购自hyclone公司，组织羟脯氨酸试剂盒、丙二醛检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。ⅰ型胶原、ⅲ胶原抗体及二抗等相关试剂均购自北京鼎国生物技术有限公司。
       1.2 动物 昆明种小白鼠，出生24 h内，用于原代皮肤成纤维细胞培养，由上海中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：scxk(沪)2007-0005。
       1.3 方法
       1.3.1 原代皮肤成纤维细胞的培养 出生24 h内的新生鼠于75％酒精浸泡片刻，取出，置于hank’s缓冲液，取背部皮肤，依次于hank’s缓冲液、1640培养液、20％胎牛血清的1640培养液中漂洗，剪碎、植块培养。
       1.3.2 光老化模型建立及虫草多糖的保护 将培2～3代的皮肤成纤维细胞转入六孔板，细胞长至50％ ～60％ 。正常对照组：正常培养液培养；光老化组：加入100 ng/ml 8-mop预先孵育24 h，予uva2.7 j/cm²照射(uva功率为190 μw/ cm²)，造模完成后换正常培养液；虫草保护组：100 ng/ml 8-mop与虫草多糖共同孵育24 h后，予uva2.7 j/ cm²照射，虫草多糖浓度为20μg /ml和40μg /m。
       1.3.3 超微结构观察 细胞造模及保护后24 h，收固定于4％戊二醛磷酸缓冲溶液中，4℃，保存1 h；pbs冲洗；1％ 锇酸，4℃ ，后固定1 h；pbs冲洗；50％ 、70％ 、80％ 、90％ 、100％ 乙醇梯度脱水；100％丙酮浸透15-30 min；包埋剂包埋；分别在37℃ 、45℃、60℃，各24 h聚合；用超薄切片机切成50nm的超薄切片；醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色；透射电镜观察照相。
       1.3.4 羟脯氨酸、丙二醛含量检测造模后24 h，受细胞培养液测丙二醛，细胞用胰酶消化收集，pbs洗2遍，各组加400μl三蒸水，反复冻溶3次，3500r/min离心10 min，取上清测羟脯氨酸含量。方法按试剂盒说明书进行，每次检测同时进行总蛋白检测，重复3次。
       1.3.5 细胞免疫化学染色 细胞造模及保护后4 h，4％戊二醛固定15 min，pbs洗3次，正常非免疫血清，孵育30 min，一抗孵育60 min，pbs洗3次，二抗孵育30 min，显色和复染后拍照。
       1.4 统计学方法 各组间比较采用t检验统计分析。
       2 结果
       2.1 对与胶原合成相关细胞器形态改变的影响 皮肤成纤维细胞合成的蛋白质主要是胶原，正常对照组：与蛋白质合成功能相关细胞器呈功能旺盛状态，光老化组细胞器功能呈不活跃状态，虫草多糖保护组明显改善。细胞超微结构改变如下：对照组细胞边界清晰，核呈不规则形态，边界清晰，核质均一，核仁均质，胞质内细胞器较多，线粒体成颗粒状或短杆状，形态清晰，线粒体嵴清晰可见，粗面内质网多，多数成管网状，内质网腔内有着色的均质颗粒，为蛋白质，提示细胞功能旺盛；光老化组细胞边界模糊，核也为不规则形态，但核质不均一，核仁内基质尤其明显，呈边集现象，胞质内线粒体少，粗面内质网少，多成空泡状，内质网腔内无着色颗粒，说明细胞功能不活跃；虫草多糖保护组，20μg /ml组和40 μg/ml组，细胞形态明显改善，细胞核内及核仁内基质变均匀，内质网也多成管网状，内有着色颗粒，线粒体也增多，说明细胞功能有了较好的改善。
       2.2对羟脯氨酸含量及丙二醛的影响 羟脯氨酸含量检测结果显示，在光老化组，细胞的羟脯氨酸含量较对照组明显下降，而虫草多糖保护组的羟脯氨酸含量明显回升，并且差异有显著性，该指标反应的是细胞胶原蛋白的含量。丙二醛含量检测显示，在光老化组，丙二醛较对照组明显增高，虫草多糖保护组明显降低，该指标反应的细胞氧化程度，老化的细胞氧化程度高，年轻的细胞氧化程度低。
       2.3 对细胞胶原种类的影响 免疫细胞化学结果显示：i型、ⅲ型胶原均表达在细胞质中，染成蓝色，在正常对照组细胞中细胞数量较多，i型胶原表达较多；光老化组细胞量减少，细胞质染色较少；在虫草保护组、20μg /m1组，细胞数量较对照组多，胞质染色也较深，而虫草多糖浓度为40μg /ml，胶原的表达也较模型组要多，但较20μg/ml组没有增加。ⅲ型胶原在正常对照组细胞中，表达较少，细胞质被染成很淡的蓝色，光老化组较对照组胶原表达较多；在虫草保护组，2oμg/ml组，细胞数量较对照组多，胞质染色较模型组淡，而虫草多糖浓度为40μg/ml，胶原的表达也较模型组更淡。
       3 讨论
       中医认为皮肤衰老与肾精亏虚、肺气不足密切相关。中医补肾药方可延缓衰老。冬虫夏草味甘性温，归肾、肺二经，具有补肺益肾，止血化痰的功效，主治肾虚阳痿、肺虚久咳、病后体虚等，而虫草多糖是冬虫夏草的主要活性成分之一，具有抗肝纤维化、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗急慢性肾衰等药理作用。抗衰老方面的研究相对较少，李连德等采用从虫草深层发酵产物中提取的多糖进行果蝇抗衰老试验；结果表明，不同来源的虫草多糖对果蝇寿命均有不同程度的延长作用，从而证明虫草多糖有延缓衰老的作用，并且延寿的效果随纯度的增大而提高。关于虫草多糖保护皮肤光老化的研究国内除本实验室外未见报道。
       成纤维细胞是真皮中最主要的细胞成分，在皮肤光老化的形成中具重要作用，对成纤维细胞在皮肤光老化形成中的作用进行研究，可以为阐明皮肤光老化的形成机制及寻找有效的防治手段提供理论依据，同时也为阐明细胞衰老与器官老化之间的关系提供线索。以8-mop/uva作用于体外培养的真皮成纤维细胞可以为体外研究皮肤光老化提供很好的模型 。哺乳动物及人类皮肤的老化与胶原蛋白有着密切关系。胶原蛋白是皮肤组织中细胞外基质的主要成分，主要是由真皮层中的皮肤成纤维细胞合成，正常情况下i型胶原含量最多，但在光老化细胞中，胶原含量减少，其中i型胶原比率减少，ⅲ型胶原含量相对增多。
       本实验结果表明，100 ng/ml 8-mop联合2.7 j/cm²的uva照射作用下，体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞形态显示蛋白质合成功能降低，提示胶原合成能力下降；羟脯氨酸含量降低，说明细胞的胶原含量减少，并且细胞氧化程度增加；免疫细胞化学染色也显示i型胶原含量减少，ⅲ型胶原含量增多。而在预先用虫草多糖保护的细胞各种改变均受到了明显的抑制，但是在2oμg/ml和40 μg/ml两组间差异不明显，仅有部分指标有差异，说明增加剂量对光老化的保护作用没有明显优势。
       虫草多糖能够保护皮肤成纤维细胞的光老化的机制可能与tgf-β/smad信号有关。目前发现紫外照射通过抑制tgf-β信号传导途径引起皮肤组织胶原含量的减少。现有研究发现，tgf-β/smad信号在多种组织中都参与了胶原的合成，或者引起了组织的纤维化，目前研究者也试图从干预该信号途径方面来寻找治疗组织纤维化、皮肤创伤愈合及瘢痕形成。在保护皮肤光老化的机制方面，tanaka h等的研究发现，革兰氏阴性厌氧菌zy-momonas mobilis的可发酵代谢物通过提高tgf—β/smad信号来改善皮肤成纤维细胞的光老化，该代谢物可以抑制uvb照射引起的tβr—ii mrna和蛋白的下降，从而恢复i型胶原合成的下降，抑制了光老化。虫草多糖对成纤维细胞光老化的保护或许也可通过影响tgf-β/smad信号来实现。本实验室另有研究也发现虫草多糖在保护细胞光老化过程中改变了tgf-β受体的表达，其机制有待进-步研究。

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