作者：顾国胜 任建安 李宁 黎介寿
       摘要 目的：探讨冬虫夏草对大鼠小肠黏膜机械屏障功能的影响。 方法：实验分为正常对照组、内毒素灌胃组和内毒素灌胃 冬虫夏草组。内毒素灌胃组于实验开始第1天给予内毒素5 eu/kg灌胃，内毒素灌胃 冬虫夏草组每天给予冬虫夏草5g(kg·d)混悬液灌胃，对照组给予等量的等渗盐水灌胃，三组均自由进食和饮水。分别于灌胃第4、7、l0天取8只大鼠，取小肠黏膜行流式细胞仪检测黏膜细胞的增殖指数(pi)，透射电镜检测黏膜上皮细胞间紧密连接宽度，免疫组化染色检测黏膜增殖细胞核抗原(pcna)。 结果：内毒素灌胃 冬虫夏草组大鼠肠黏膜细胞的pi、pcna比例和肠黏膜上皮细胞间的紧密连接第7天即恢复至正常水平，与内毒素灌胃组相比，有显著性差异。 结论：冬虫夏草可促进大鼠小肠黏膜细胞的增殖，维持小肠黏膜上皮细胞间紧密连接的完整性，保护肠黏膜的机械屏障功能。
       近年来，肠功能已作为判断危重症病人预后的重要条件之一，肠道被认为是机体应激时的中心器官之一。完整的肠上皮、上皮间紧密连接(tj)和基膜等构成肠道机械屏障，是阻挡微生物入侵的第一道防线，在肠屏障功能中起了很重要的作用。以往的研究表明，冬虫夏草可促进细胞增殖，但其对小肠黏膜机械屏障的研究较少。为此，我们探讨了冬虫夏草对大鼠小肠黏膜机械屏障功能的影响。
       1 材料和方法
       1.1 动物和材料56只健康sd大鼠，体重150～200g，雌雄各半，由本院解放军动物医学实验中心提供。冬虫夏草粉由杭州中美华东制药有限公司提供，每1g冬虫夏草粉溶于5ml等渗盐水中，制成冬虫夏草混悬液。碘化丙啶溶液试剂盒由联科生物技术工程公司提供。细菌内毒素和增殖细胞核抗原(pcna)免疫组化试剂盒由深圳晶美公司提供。
       1.2 动物分组和处理 将大鼠随机分为正常对照组(a组，8只)、内毒素灌胃组(b组，24只)、内毒素灌胃 冬虫夏草组(c组，24只)。b组于实验开始第1天给予内毒素5eu/kg灌胃，c组第1天给予内毒素5eu/kg灌胃，同时给予冬虫夏草5g(kg·d)混悬液灌胃，连续10d；对照组给予等量的等渗盐水灌胃，三组大鼠均自由进食和饮水。分别于灌胃当天和第4、7、10天取8只大鼠作相关指标测定。
       1.3 指标检测
       1.3.1 小肠黏膜细胞增殖指数(pi) 剖腹取空回肠交界处小肠5cm，机械法刮取肠黏膜，经medima—chine系统制备成单细胞悬液后，加入荧光染料碘化丙啶溶液，经流式细胞术(fcm)测量，可获得dna含量分布组方图或细胞凋亡比例。采用专门的计算机拟合程序(dna细胞周期分析程序)，快速计算出各期细胞的分布百分比，用s g₂m期或s期细胞百分比，以表示细胞群体的增殖状态和dna合成速度。
       1.3.2 细胞间紧密连接取大鼠小肠切成1mm×1mm×2mm，迅速投人4℃的3％戊二醛-1.5％多聚甲醛-0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.2)，前固定2h以上。经缓冲液漂洗后，用1％饿酸4℃下固定1.5h，再漂洗后用系列乙醇、丙酮脱水，环氧树脂618包埋，经半薄切片定位。60nm超薄切片，用醋酸铀、枸橡酸铅染色。置透射电镜下观察摄片。
       1.3.3 小肠黏膜增殖细胞核抗原检测 石蜡切片按常规脱蜡至水，在体积分数为3％的h₂0₂中孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性。pbs冲洗，置于0.o1mol/l、ph6.0的枸橼酸盐缓冲液中行抗原热修复后，滴加1：100稀释一抗，37℃下孵育40min。pbs冲洗，滴加辣根过氧化物酶(hrp)标记二抗，37℃下孵育20min，pbs漂洗后dab显色，苏木精对比染，常规脱水、透明、封固，在显微镜下观察。结果以细胞质和(或)细胞核着棕色者为阳性染色。另用pbs代替一抗为阴性对照。结果判定与分析：在光镜下观察阳性细胞数和在组织中的分布。在目镜为10倍、物镜为40倍的条件下，选择具有良好隐窝腔的纵切面，从隐窝底部中央细胞开始，依次向上计数阳性细胞和阴性细胞，直至隐窝与绒毛交界处。每张切片需计数10个隐窝，计算阳性细胞的比例。
       1.4 统计学方法 所有数据运用spss13.0软件完成统计学的各项处理，以x±s表示。试验过程中得到的数据均输入本实验的数据库，多组间资料比较采用one-way anova单因素方差分析，两组间比较运用least-significant difference法。p≤0.05为差异有显著性统计学意义。
       2 结 果
       2.1 小肠黏膜细胞增殖指数 c组及b组第4天肠黏膜细胞的pi与a组比明显下降。至第7天，b组仍低于a组，而c组恢复至a组水平。至第10天，c组较a组比明显增高，而b组才恢复至正常水平，见表l。
       2.2 小肠黏膜上皮细胞间的紧密连接 c组和b组第4天黏膜上皮细胞间的pcna与a组比出现明显变化，至第7天，b组恢复至正常水平，而c组变化更为明显，且与b组有显著性差异，见表2。
       2.3 小肠黏膜pcna的变化 c组和b组第4天黏膜pcna与a组比出现明显变化；至第7天，b组恢复至正常水平，而c组变化更为明显，且较b组有显著性差异，见表3。
       3 讨 论
       近来研究表明，肠道在感染、应激所致全身性炎症反应综合征(sirs)和多器官功能障碍综合征(mods)的发展中居重要地位。肠黏膜是代谢活跃的组织细胞群，更易受缺血、缺氧和炎症反应等因素的伤害。感染、创伤等应激和长期禁食后使肠黏膜蛋白质合成能力下降，肠黏膜上皮细胞修复、更新受损，严重者出现肠黏膜萎缩。肠黏膜结构和功能的损害，影响肠黏膜屏障功能。在正常生理状况下，细菌和毒素并不对机体产生危害。这与机体各系统之间的相互协调和肠道特有的屏障功能有关。完整的肠上皮、上皮间tj和基膜等构成肠道机械屏障，是阻挡微生物入侵的第一道防线。一旦机械屏障遭到破坏，细菌和毒素可穿过肠壁，侵入肠系膜淋巴结、血液、肝、脾等器官，即发生肠道细菌易位(bt)。肠道bt是内源性感染发生率难以降低的主要原因之一。同时，肠道损害是许多疾病或损伤后多器官功能障碍的中心器官和始动因素。因此，如何促进肠道屏障功能的恢复，维持微生态平衡是急待解决的问题。
       以往的研究表明，冬虫夏草能促进细胞的增殖。虫草水提液可使小鼠脾的吞噬细胞增殖，增加肝的重量，肝内肝巨噬细胞功能增强；虫草多糖不仅可增加脾的重量、脾中浆细胞增殖、使脾营养性血流量增加，而且还能拮抗可的松或环磷酰胺所致脾萎缩的作用；虫草提取物不仅能促进正常小鼠脾活化t细胞的增生，而且还能使受环磷酰胺和氢化可的松抑制的小鼠脾活化t细胞恢复正常。虫草多糖脂质体对体外培养的外周血淋巴细胞，可单独或协同外源凝集素(pha)诱导il-22受体的表达，促进可溶性il-22的生成。
       以往的实验还证明，虫草具有明显的促肾小管上皮细胞增殖的作用，且在一定范围内随剂量增大而增强；虫草还能促进人类单核巨噬细胞的分化和增殖。口服冬虫夏草液对辐射诱发的小肠急性损伤有一定的保护作用。对于辐射所引起的骨髓抑制，虫草也有很好的保护作用。
       本实验结果显示，给予内毒素灌胃后第4天，肠黏膜机械屏障明显受损，表现为肠黏膜pi明显下降，细胞问tj增大，肠道通透性增加，细胞pcna的比例明显下降；至第7天时，两组均恢复至正常水平，但c组变化更为明显。本研究证实冬虫夏草不仅具有促进肠黏膜增殖的作用，而且还有修复内毒素破坏的肠黏膜tj作用。

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